Gesamt-RNA-Extraktion aus Pflanzengewebe

Die Methode kann dazu verwendet werden aus demselben Pflanzenmaterial sowohl RNA, als auch DNA und Proteine zu gewinnen. In diesem Fall wurde das Protokoll auf die RNA-Gewinnung in Pflanzen optimiert. Das normalerweise verwendete TRIzol (Gibco, BRL) wurde durch den Extraktionspuffer. Die Methode basiert auf einer Phenol/Chloroform Extraktion, die die Tatsache ausnutzt, dass RNA sich besser in der hydrophilen, wässrigen Phase löst, während Chlorophyll und andere Bestandteile besser in der hydrophoben Chloroform-Phase gelöst werden. Die beiden Thiocyanat-Salze im Extraktionspuffer inhibieren RNAsen und verhindern damit eine Degradation der RNA. Die Fällung der RNA mit Isopropanol, sowie den Salzen NaCl und Natriumcitrat dient der Einengung des Volumens.

  • Mörser und Pistille werden vor Gebrauch mit Seifenlösung ausgerieben und 2-3 mal mit Wasser nachgespült, mit Ethanol ausgesprüht und trocknen gelassen

  • Mörser und Pistill mit flüssigem Stickstoff vorkühlen

  • Ca. 1g des zuvor bei -80°C gelagerten Pflanzenmaterials abwiegen

  • Im Mörser das Pflanzenmaterial zu einem feinen Pulver zerreiben, bei Bedarf etwas flüssigen Stickstoff nachfüllen

  • Spatel in flüssigem Stickstoff vorkühlen und dann damit Pulver in Sarstedt 12 ml Red-Cap Röhrchen einfüllen

  • Pulver etwas antauen lassen und dann 10 ml RNA-Extraktionspuffer zugeben, kräftig vortexen, um das Pulver gleichmäßig zu verteilen

  • Lösung in Zentrifugenröhrchen umfüllen und 5´ bei RT inkubieren

  • Zugabe von 2 ml (200 µl/ml eingesetzter Extraktionspuffer) Chloroform und ca. 15'' stark schütteln

  • Inkubation für 2-3´ bei RT

  • Phasen-Trennung durch Zentrifugation in Sorvall RC BP plus (SS34 Rotor) bei 10000 rpm für 15´

  • In einem neuen Zentrifugenröhrchen werden 2,5 ml Isopropanol und 2,5 ml des Fällungpuffers vorgelegt, Zugabe der oberen,wässrigen Phase

  • Die Lösung wird invertiert und 10´bei RT inkubiert

  • Zentrifugation wie oben beschrieben für 10´

  • Es wird ein weißes, festes Pellet am Boden sichtbar, der Überstand wird abgenommen und Röhrchen für 1-2' umgekehrt auf ein Laborhandtuch gestellt

  • Zugabe von 1 ml 75% Ethanol, vorsichtig schwenken, dann erneut wie oben beschrieben zentrifugieren

  • Überstand mit Gilson-Pipette abnehemn und Pellet 5-10´ (nicht länger, da es sich sonst schlecht wieder löst) bei RT trocknen, Pellet wird dabei meist durchsichtig, das gesamte Ethanol muß entfernt werden

  • Zugabe von 100-150µl H2O und Pellet durch auf und ab pipettieren lösen, 1-2´ auf Eis stehen lassen

  • Zentrifugation wie oben beschrieben für 10´, anschließend wird der Überstand in ein neues Eppendorff Cup überführt

    Na-Acetat Puffer     3M Na-Acetat
          mit Essigsäure auf pH 5.2 einstellen


    RNA-Extraktionspuffer 380 ml/l Phenol mit 0,1M Citrat Puffer gesättigt
          0,8 M Guanidiniumthiocyanat
          0,4 M Ammoniumthiocyanat
          33,4 ml/l Na-Acetat (3M Stammlsg.) pH 5,2
          5% Glycerin

    Fällungspuffer 1,2 M NaCl
           0,8 M tri-Natrium-Citrat




    Literatur:

    AFGC Micoarray Services RNA Instructions [online]
    Copyright: AFGC, letzte Aktualisierung 26.06.2002, erhältlich im Internet unter
    http://afgc.stanford.edu/afgc_html/afgc-array-rna.html


    Chomczynski P., 1993
    A Reagent for the Single-Step Simultaneous Isolation of RNA, DNA and
    Proteins from Cell and Tissue Samples.
    BioTechinques 15: 532-538


    Chomzynski P., Sacchi N., 1987
    Single-Step Method of RNA isolation by Acid Guanidinium
    Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction.
    Anal Biochem 162: 156-159